PEWARNAAN GRAM
A. Hari/ Tanggal : Selasa / 31 Mei 2011
B. Judul : Pewarnaan Gram
C. Tujuan :
1. Melihat jenis bakteri gram.
2. Mempelajari pewarnaan gram.
D. Teori :
Christian Gram (1884) : “Pewarnaan gram atau pewarnaan deferensial (deferensial stain) yaitu pewarnaan yang menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Cara pewarnaan ini dikembangkan oleh ahli bakteriolog”.
Irawan (2008) : “Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel. Cara ini digunakan untuk menentukan bakteri gram positif atau gram negatif.”
Pada pewarnaan gram digunakan dua macam zat warna, yaitu zat warna utama yang diberikan pertama kali pada objek atau sel bakteri dan zat warna kedua atau penutup (cover stain).
Bakteri gram positif yaitu bakteri yang tetap mengikat warna utama. Sedangkan bakteri gram negatif adalah bakteri yang warna utamanya dapat dilunturkan dan mengikat warna penutup. Bakteri gram positif mempunyai lapisan peptidoglycan yang tebal.
Irawan (2008), hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut:
1. Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.
2. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.
E. Alat dan Bahan
1. Membiakan murni dari Bacillus substilis dan Escerchia colli, atau suspensi dari bakteri tersebut dalam air steril.
2. Zat warna:
a. Cystal violet (modifikasi Hucker)
b. Larutan Iodium Gram
c. Safranin
3. Alkohol 95%
4. Bak pewarna
5. Aquadest dalam botol semprot
6. Kertas hisap
7. Mikroskop
8. Jarum inokulasi / ose
9. Lampu spirtus
10. Kaca objek, kaca sediaan
11. Pansil kaca
12. Xylol
13. Minyak emersi
F. Cara Kerja
1. Menyiapkan 2 buah kaca objek yang bersih.
2. Membuat film bakteri pada kaca sediaan, dengan garis tengah ± 1cm.
3. Fiksasi.
4. Membersihkan zat warna kristal violet selama 1 – 2 menit.
5. Membuang kelebihan zat warna.
6. Membilas dengan air mengalir.
7. Meneteskan larutan pewarna iodium gram, selama 2 menit setelah agak kering
8. Membuang kelebihan zat warna.
9. Membilas dengan air.
10. Meneteskan larutan alkohol 95% sedikit demi sedikit, sehingga larutan yang mengalir dari noda berwarna menjadi tidak berwarna (pemucatan).
11. Membilas dengan air.
12. Meneteskan zat warna penutup, yaitu safranin berwarna merah atau karbon fuchsin selama 2 – 3 menit.
13. Membuang kelebihan zat warna.
14. Membilas dengan air.
15. Menyerap sisa air dengan kertas hisap.
G. Hasil pengamatan
H. Pembahasan
Pada praktikum ini proses pewarnaan pada bakteri E.colli menggunakan 2 macam pewarnaan yaitu metilen biru dan safranin. E.colli termasuk pada bakteri gram negatif.
Irawan (2008) : “cara untuk menentukan gram negatif yaitu mempunyai dinding sel tipis yang berada diantara dua lapis membran sel”.
Pada pewarnaan gran digunakan dua macam zat warna, yaitu zat warna utama yang diberikan pertama kali pada objek atau sel bakteri dan zat warna kedua atau penutup (cover stain). Bakteri yang kami gunakan dalam praktikum ini adalah bakteri E.colli yang menyukai tempat asam, oleh karena itu pewarna yang digunakan adalah pewarna yang bersifat basa yakni safranin, karena dapat mengikat pewarna penutup. Pengikatan yang dilakukan bakteri E.colli menyebabkan latar belakang pada objek berwarna merah, sedangkan apabila bakteri gram negatif maka latar belakang akan berwarna biru. Setelah pewarnaan selesai objek telah kering, maka dilakukan pengamatan dengan menggunakan mikroskop. Mula-mula dilakukan dengan pembesaran yang terkecil, yaitu pembesaran 10x, objek terlihat seperti bintik-bintik kecil dengan bentuk. Kemudian diamati dalam pembesaran 40x, E.colli terlihat berbentuk bulat yang sangat kecil dan membentuk koloni berupa rantai yang memanjang dengan latar berwarna merah.
I. Kesimpulan
Berdasarkan pembahasan, dapat disimpulkan sebagai berikut:
1. Pewarnaan gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.
2. Bentuk dari bakteri E.colli adalah bulat bening berukuran sangat kecil dan membentuk koloni rantai yang memanjang.
3. E.colli termasuk ke dalam kelompok bakteri gram negatif karena E.colli mampu mengikat pewarna penutup yaitu safranin yang berwarna merah.
J. Referensi
Tidak ada komentar:
Posting Komentar